小麦策略 Star-Oddi小型传感器非洲水牛的病毒动态和对口蹄疫病毒的免疫反应_临床_动物_疾病

口蹄疫（FMD）是限制国际贸易的最重要的牲畜疾病之一。虽然非洲水牛（非洲水牛属）是主要的野生动物病毒宿主，但此前尚未有关于该物种在口蹄疫病毒急性感染期间的病毒和免疫反应动态的描述。我们通过对三种南部非洲地区血清型进行实验性针刺接种和接触感染，来评估感染后三十天内的临床、病毒学和免疫学动态。针刺接种的水牛的口蹄疫临床症状较轻，以发热为特征。尽管没有出现全身性水疱，但所有接触的动物在与针刺接种的水牛混群后的最初两到九天内，都很容易感染各自相应的血清型。无论感染途径或血清型如何，血液中的病毒载量与宿主先天性促炎细胞因子和急性期蛋白的诱导之间都存在正相关关系。在感染的急性期，血液和扁桃体拭子中的病毒载量密切相关，然而，病毒血症在感染后四天（dpi）达到峰值后显著下降，这与可检测到的中和抗体的出现相关。相比之下，在大多数动物中，直到最后一个采样点（30 dpi）时，仍能从扁桃体拭子中分离出有传染性的病毒。在直接接种和接触接种的动物中，对于所有三种血清型，血清和扁桃体拭子中病毒检测的模式是相似的。我们首次证明，非洲水牛确实会受到口蹄疫病毒的全身性影响小麦策略，并且水牛的口蹄疫临床特征表现为短暂性发热。尽管没有口蹄疫病变，但非洲水牛的感染特征是血液和口咽部病毒载量高、宿主先天性和适应性免疫反应迅速且强烈，以及传染性高。

一、引言

口蹄疫（FMD）是一种急性水疱性病毒性疾病，影响家养和野生偶蹄动物，具有高度传染性且潜伏期极短。在口蹄疫易感牲畜（如牛、羊和猪）的疾病急性期，临床症状包括发热、出现水疱样病变，随后在舌头、口腔、口鼻和蹄部出现糜烂。口蹄疫确实是非洲流行的最重要的畜牧业疾病之一，对畜牧业造成严重的社会经济影响，并阻碍国际贸易。人们对野生动物自然感染口蹄疫的发病机制知之甚少，但有描述称，在实验感染后，口蹄疫对瞪羚和疣猪可能是致命的，而在非洲水牛中通常可见临床上无明显症状的感染。

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口蹄疫病毒（FMDV）是一种小型（直径 30 纳米）、大致呈球形、无包膜、正链单股 RNA 小核糖核酸病毒，属于口蹄疫病毒属。鉴于其血清学多样性，口蹄疫病毒被分为 7 种血清型：A、O、Asia1 和 C（也称为欧亚血清型）以及南部非洲地区（SAT）1、2 和 3 型，它们在全球的分布各不相同，但引发的疾病难以区分。

口蹄疫病毒主要在急性感染期间，通过受感染动物与未感染动物的密切接触直接传播。口蹄疫病毒的传播率非常高，在疾病早期，牛的基本再生数（R0）值被认为是 21–88，羊的是 1–14 ，而最近估计非洲水牛的 R0 值为 5–15.8 。在牛中，感染后 3–4 天出现临床症状，平均在临床症状出现后 0.5 天开始传播，此时由于水疱形成和水疱液，在受损的上皮组织中可发现非常高滴度的病毒。与牛不同的是，非洲水牛在实验性感染高剂量的三种南部非洲地区血清型后会发生亚临床感染，而相同的病毒株在年轻的恩古尼牛中会导致致命的急性口蹄疫。在牛中，自然感染后鼻咽黏膜是主要的复制部位，随后病毒扩散到肺部，接着出现持续约 3–5 天的病毒血症。控制口蹄疫病毒感染的主要机制是诱导中和抗体，感染后最快 4 天（dpi）即可检测到中和抗体，在 14 dpi 时达到峰值，并能维持很长时间（数年）。由感染或疫苗接种诱导的体液免疫反应可保护动物免受口蹄疫侵害，但并不能始终如一地阻止病毒在鼻咽部的复制以及持续感染或带毒状态的形成。

基于 I 型和 III 型干扰素（IFN）的先天性非特异性免疫反应，已被证实可在猪和牛对口蹄疫病毒的早期保护性反应中发挥作用。事实上，尽管口蹄疫病毒在体外已经发展出了对抗干扰素反应的机制，但在牛、猪、小鼠和非洲水牛感染口蹄疫病毒后，仍能在血清中很容易地检测到 I 型 / III 型干扰素。

有研究表明，在牛急性感染口蹄疫病毒期间，血清中的急性期蛋白（APPs）、结合珠蛋白和血清淀粉样蛋白 A（SAA）的产生会增加。有趣的是，急性期蛋白的检测已被用作一系列传染病的指标，用于监测疾病进展、作为评估农场或屠宰场动物健康和福利的标志物、评估抗生素治疗效果，并且最近还被用作非洲水牛其他感染的生物标志物。

撒哈拉以南非洲的大多数非洲水牛都地方性感染了所有三种南部非洲地区血清型，并且被认为是主要的口蹄疫病毒宿主，对一些研究人员来说，甚至是唯一的宿主，因为它们可能会持续感染多年。控制口蹄疫等跨境疾病对于提高流行地区的牲畜生产力以及促进畜产品的国际贸易至关重要。在撒哈拉以南非洲控制口蹄疫面临着独特的挑战，因为南部非洲地区血清型在野生动物中持续存在，并成为牲畜的感染源。因此，非洲牲畜口蹄疫控制的一个重要因素是了解非洲水牛的发病机制和传播性。SAT2 型是分布最广泛的血清型，也是最常与牲畜和野生动物疫情相关的血清型，其次是 SAT1 型，然后是 SAT3 型。然而，与牛相比，关于非洲水牛在急性感染期间的病毒动态、病毒排出、传播率以及宿主免疫反应的信息却知之甚少。

因此，本研究的目的是填补非洲水牛在针刺或直接接触感染三种南部非洲地区口蹄疫病毒血清型后，对口蹄疫病毒感染动态和免疫发病机制方面的知识空白。我们分析了病毒血症、病毒排出、临床结果和发热等参数，以及血清中急性期蛋白的全身水平和先天性及适应性免疫反应。尽管没有可见的临床症状，但受感染的水牛表现出体温升高、血液和鼻咽部病毒滴度高，并且很容易将病毒传播给未感染的水牛。

二、材料与方法

01.实验设计与采样

24 头非洲水牛（非洲水牛属）由南非的一处禁猎区捐赠；经相关实验室确认其没有口蹄疫病毒（FMDV）抗体后，被转移到实验动物设施中。让这些动物适应环境一个月，并在整个实验过程中每天对它们的健康状况进行监测。实验方案得到了相关部门和动物伦理委员会的批准。在实验操作和样本采集过程中，使用药物对动物进行镇静。

这 24 头水牛，12 头雌性和 12 头雄性，年龄在 10 至 24 个月之间，被随机分为六组，每组有两头雄性和两头雌性。三组动物分别用 SAT1、SAT2 或 SAT3 型口蹄疫病毒进行皮内攻毒，剂量为在舌部接种 2.5×10⁵ TCID50（半数组织培养感染剂量）。在本文中，这些组的动物将被称为 “针刺感染（NI）” 动物。感染两天后，将剩下的三组共 12 头未感染的水牛与已接种病毒的三组动物分别混群；这些动物被称为 “接触感染动物”。在急性感染期的 30 天内，对针刺感染和自然接触每种南部非洲地区（SAT）病毒的水牛的口蹄疫病毒感染动态进行了研究。所有的感染同时进行，每一种血清型对应的 4 头针刺感染水牛和 4 头接触感染水牛被饲养在大约 300 平方米的户外围栏中，每个围栏之间用双层围栏隔开。在每个围栏内，为动物提供一个棚舍，并且在共享的食槽中提供充足的食物和水。

对水牛是否出现口蹄疫临床症状进行监测，并在第 0 天（针刺感染当天）、第 2 天（接触感染水牛与针刺感染水牛混群当天）、第 4 天、第 6 天、第 8 天、第 11 天、第 14 天和第 30 天进行采样。样本采集包括血液、口咽刮取物（探杯采样）、鼻腔和扁桃体拭子。从颈静脉采集的全血样本经过离心提取血清，以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）法测量促炎细胞因子（I 型 / III 型干扰素、γ 干扰素、肿瘤坏死因子 α）和急性期蛋白（APP）；并通过病毒中和试验（VNT）和 ELISA 法测量特异性体液免疫反应。采集后的血液样本也会收集在乙二胺四乙酸（EDTA）中，立即用血细胞计数设备进行白细胞计数。收集血清、探杯采样样本和扁桃体拭子样本，用于通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测口蹄疫病毒和进行病毒分离。探杯采样样本是通过用探杯轻轻刮擦口咽上皮获得的。将上皮组织重悬于 3 毫升的探杯缓冲液（添加了青霉素 / 链霉素的伊格尔 - Hepes 缓冲液）中，并在液氮中迅速冷冻。用尼龙刷分别擦拭左右腭扁桃体，将刷子浸入含有 0.5 毫升探杯缓冲液的冻存管中，并在液氮中迅速冷冻。将棉质鼻腔拭子浸泡在 0.5 毫升的磷酸盐缓冲液（PBS）中，然后插入两个鼻孔以收集鼻腔分泌物。然后对拭子进行离心，收集液体并分装。所有样本在处理前都保存在−80°C 环境中。

02.病毒与细胞系

用于口蹄疫病毒攻毒的病毒分离株分别是 SAT1、SAT2 和 SAT3，其登录号分别为 KR108948、KR108949 和 KR108950。这些病毒最初来自水牛，在原代猪肾细胞（PK）中分离，并在一种猪细胞系中传代培养（5 代）。

这种猪细胞系也用于病毒中和试验。一种山羊上皮细胞用于从扁桃体拭子、探杯采样样本和血清中分离病毒。转染了表达由人 MxA 启动子驱动氯霉素乙酰转移酶（CAT）互补 DNA（cDNA）质粒的一种牛肾细胞，用于抗病毒试验以检测 I 型 / III 型干扰素。细胞系在添加了营养成分 F-12（用于山羊上皮细胞）、Hepes 缓冲液、L - 谷氨酰胺、10% 胎牛血清和抗生素（青霉素 100 单位 / 毫升和链霉素 100 微克 / 毫升）的最低必需培养基（MEM）中进行培养。这种牛肾细胞还额外添加了 10 微克 / 毫升的杀稻瘟菌素（。

03.腹部体温测量

如先前所述，使用植入本研究中的所有 24 头水牛以及另外 12 头未接触口蹄疫病毒的水牛体内的温度敏感数据记录仪（Star-Oddi 公司的 DST centi-T ），每五分钟测量一次体温。实验方案得到了相关大学动物研究伦理委员会的批准。简而言之，在水牛被镇静后，将植入部位剃毛，注射局部麻醉剂，并用消毒剂进行消毒。在腰旁窝处做一个约 5 厘米的切口。用即时消毒剂对涂有蜡的数据记录仪进行消毒，然后将其放置在腹膜和腹肌之间，并用尼龙缝线固定在周围的肌肉上。手术部位用可溶解缝线缝合，手术伤口涂上防腐剂喷雾和杀虫剂。解除镇静后观察水牛，直到它们能够站立起来。在 5 天后实验操作开始时，所有伤口都已愈合。

三、实验方法

01. 血清、口咽刮取物、鼻腔和扁桃体拭子中口蹄疫病毒（FMDV）RNA 的逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测

使用 MagNA Pure LC RNA 分离试剂盒和 KingsFisher Flex 96 自动化核酸提取仪，从 100 微升的样本（血清、口咽刮取物、鼻腔和扁桃体拭子）中提取 RNA 模板小麦策略，最终洗脱体积为 80 微升。通过 RT-qPCR 方法，使用针对口蹄疫病毒基因组保守的 3Dpol 编码区的引物来确定病毒载量。在研究的第 30 天，对扁桃体拭子样本也使用了如先前所述的南部非洲地区（SAT）血清型特异性引物和探针。在 Stratagene Mx3005P 实时荧光定量 PCR 系统上，使用 MXPro MX3005 v3 软件进行 40 个循环的 PCR 反应。通过使用体外合成的 RNA 标准品的系列稀释液建立线性回归模型，将循环阈值（Ct）值转换为口蹄疫病毒基因组拷贝数（GCN）。结果以每毫升样本中病毒基因组拷贝数的对数（Log10 GCN/mL）表示。所有样本均采用每 5 微升 RNA 中 1 个基因组拷贝（GCN）的临界值，这导致样本的检测阈值为每毫升样本中 2.2 log10 的口蹄疫病毒基因组拷贝数。

02. 空气采样

为了研究口蹄疫病毒在水牛中可能的气溶胶传播情况，我们使用科里奥利空气采样器采集针刺感染（NI）水牛呼出的气溶胶。科里奥利空气采样器将气溶胶收集在一个装有添加了抗生素的伊格尔培养基的塑料瓶中，该塑料瓶连接到一个高流量真空泵，气流速率为 300 升 / 分钟。在实验的第 0 天、第 2 天、第 4 天、第 6 天和第 8 天，将空气采样器放置在镇静状态下的针刺感染水牛嘴部约 1 米远的位置，采样 10 分钟。从塑料瓶中收集的 1 毫升培养基等分样本，通过 RT-qPCR 进行分析，以检测病毒颗粒。

03. 病毒分离

根据世界动物卫生组织《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2022 年，第 3.1.8 章）中描述的程序，在 ZZR-127 山羊上皮细胞单层中，从口咽部（OP）样本（口咽刮取物和扁桃体拭子）和血清中进行病毒分离。如果在孵育 48 小时后未观察到细胞病变效应，则在新的 ZZR-127 细胞上进行病毒的第二次传代。通过 RT-qPCR 确认出现阳性细胞病变效应的样本中存在口蹄疫病毒。

04. 通过病毒中和试验（VNT）检测口蹄疫病毒中和抗体

如其他地方所述，通过病毒中和试验（VNT）检测血清样本中是否存在同源的抗口蹄疫病毒中和抗体。简而言之，将血清进行 2 倍稀释后，与 100 TCID50（半数组织培养感染剂量）的 SAT1、SAT2 或 SAT3 型口蹄疫病毒在 96 孔板中的 IB-RS-2 细胞单层中孵育三天。计算出现细胞病变效应（CPE）的孔数，滴度以能使 50% 的孔中的病毒被中和的血清最高稀释倍数的倒数的对数（log10）表示。根据研究人员们的研究，滴度 > 1.6 log10 被认为达到了保护阈值。

05. 通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测抗口蹄疫病毒非结构蛋白的抗体

对血清样本进行分析，以检测抗口蹄疫病毒非结构蛋白（NSP）的抗体。使用 PrioCHECK FMDV NS ELISA 试剂盒，按照制造商的说明进行操作。抑制率（PI）超过 50% 的结果被认为是阳性。

06. 血清中 I 型 / III 型干扰素、肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）和 γ 干扰素（IFN-γ）的测定

使用 Mx / 氯霉素乙酰转移酶（Mx-CAT）报告基因测定法来确定血清样本中具有生物活性的干扰素的水平。简而言之，将血清样本在 37°C 和 5% 二氧化碳条件下，与 MDBK-t2 细胞孵育 24 小时。然后用裂解缓冲液裂解细胞，根据制造商的说明，使用 ELISA 试剂盒（目录号：113637270001）从细胞裂解物中测定由血清中存在的抗病毒蛋白诱导的氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达。每毫升血清中的抗病毒活性单位通过使用重组牛干扰素 -α 建立的标准曲线计算得出。通过测量基础水平的平均值加上两倍标准差，确定了 0.76 国际单位 / 毫升的临界值。

使用商业 ELISA 试剂盒（目录号：ELB-TNFa-1），按照制造商的方案测定水牛血清中肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）的水平。结果以每毫升血清中肿瘤坏死因子 -α 的微克数（µg/mL）表示。通过测量基础水平的平均值加上两倍标准差，确定了 1.76 µg/mL 的临界值。

使用商业牛 γ 干扰素夹心 ELISA 检测试剂盒（产品代码：MCA5638KZZ），按照制造商的说明对水牛血清中的 γ 干扰素（IFN-γ）进行定量测定。结果以从重组牛 γ 干扰素标准曲线外推得到的每毫升血清中 γ 干扰素的微克数（µg/mL）表示。通过测量基础水平的平均值，并将平均值加上两倍标准差，确定了 1.04 µg/mL 的临界值。

07. 血清中急性期蛋白的测定：血清淀粉样蛋白 A（SAA）和结合珠蛋白

按照制造商的说明（目录号：SAA-11），使用夹心 ELISA 法检测水牛血清样本中血清淀粉样蛋白 A（SAA）蛋白的水平。结果以纳克 / 毫升（ng/mL）报告。通过测量基础水平的平均值加上两倍标准差，确定了 546 ng/mL 的临界值。

使用一种针对牛的、基于夹心 ELISA 法的商业试剂盒（目录号：HAPT-11），按照说明对水牛血清中的结合珠蛋白进行定量测定。结果以纳克 / 毫升（ng/mL）表示。通过测量基础水平的平均值加上两倍标准差，确定了 802 ng/mL 的临界值。

08. 统计分析

使用 R 语言（版本 3）计算初始体温升高值、最高体温以及高体温持续时间，并通过克鲁斯卡尔 - 沃利斯检验（Kruskal–Wallis test）进行分析。通过确定每只动物的曲线下面积（AUC）、最大值以及检测到峰值的日期，来分析血清和扁桃体拭子样本中的病毒载量、口蹄疫病毒免疫反应（病毒中和试验（VNT）、肿瘤坏死因子（TNF）、γ 干扰素（IFN-γ）和 I 型 / III 型干扰素）以及血清中急性期蛋白（结合珠蛋白和血清淀粉样蛋白 A）随时间的变化情况。对于病毒载量（血清和扁桃体拭子中的）、病毒中和试验（VNT）和非结构蛋白（NSP）检测，还确定了首次出现阳性值的日期。最后，根据血清中的病毒载量估计病毒血症的持续时间；持续时间定义为首次观察到 log10 值的中点与前一次阴性观察值之间的间隔，以及最后一次观察到 log10 值的中点与后续阴性观察值之间的间隔。反应时间的测量方法为每个参数首次出现阳性值的时间减去检测到口蹄疫病毒的第一天（在扁桃体拭子、血液或鼻腔中检测到口蹄疫病毒的存在）。

使用克鲁斯卡尔 - 沃利斯检验（Kruskal-Wallis test），比较针刺感染动物和接触感染动物之间（不考虑血清型）以及针刺感染动物和接触感染动物中不同血清型之间（根据暴露时间进行校正）的所有测量值。按血清型（SAT1、SAT2 和 SAT3）分层的病毒载量、血清学和免疫学数值的中位数、最小值和最大值以及克鲁斯卡尔 - 沃利斯统计量见附加文件 3。按感染方式（针刺感染与接触感染）分层的病毒载量、血清学和免疫学数值的中位数、最小值和最大值以及克鲁斯卡尔 - 沃利斯统计量见附加文件 4。通过斯皮尔曼等级相关检验（Spearman’s rank test），分析血清和扁桃体拭子中的病毒载量之间、首次检测到发热与扁桃体拭子和血清中口蹄疫病毒之间的相关性。

四、结果

01. 口蹄疫病毒从针刺接种水牛向接触感染水牛的传播

口蹄疫病毒在混群后的第一周内很容易从针刺感染（NI）水牛传播到所有接触感染的水牛身上。正如预期的那样小麦策略，所有针刺感染的动物在感染后第 2 天，在血清和 / 或扁桃体及鼻腔拭子中同时首次检测到口蹄疫病毒。与针刺感染的动物相比，接触感染的水牛中口蹄疫病毒的检测有所延迟（p＜0.014），并且在血清型内和血清型之间的差异更大，不过所有接触感染的动物在接触病毒后的两到九天内都被感染了。由于这种差异，在分析接触感染组的免疫参数值时，考虑了首次检测到病毒的日期。在感染后，从针刺感染动物附近采集的任何空气样本中均未检测到口蹄疫病毒（数据未显示）。

SAT3 接触感染组中的一只动物感染延迟，在第 9 天才首次检测到口蹄疫病毒，由于感染发作后可用的样本有限，该动物被排除在分析之外。

02. 临床症状、体温和白细胞计数

口蹄疫病毒攻毒后，总白细胞计数没有显著变化（附加文件 5），并且在 24 只动物中只有 3 只（来自 SAT1 针刺感染组的两只动物和来自 SAT3 接触感染组的一只动物）在感染后第 6 至 11 天出现了轻微的口腔病变。病变表现为上齿龈垫上直径约 4 毫米的小圆形水疱。除了接种部位的针刺痕迹外，在蹄冠带或舌头上未观察到病变。

如图 1 和附加文件 2 所示，针刺感染后很快（大约 1.2（±0.2）天）体温就升高（＞39.3°C），并且持续升高 3.69（±1.17）天，从开始发热起 0.8（±0.6）天达到最高体温峰值＞41°C。与 SAT1 和 SAT3 针刺感染组分别在感染后 1.3 天和 1.4 天出现初始体温升高相比，SAT2 针刺感染组的反应时间更快（在感染后第 1 天）（p = 0.01）。SAT1 组的所有动物以及 SAT3 针刺感染组的一只动物，在感染后第 8 天出现了短暂的第二次发热峰值，持续时间不到一天。正如预期的那样，接触感染组内和组间的体温变化同步性较差，这反映了动物从针刺感染动物自然感染病毒的时间点和病毒剂量不同。所有接触感染的动物（除了一只 SAT1 水牛，其温度装置出现故障）在与针刺感染动物接触 4.9（±2.5）天后体温升高，体温在开始发热后约 1.3（±0.3）天达到峰值，并持续升高约 3.3 天（±1.62）天。除了 SAT3 组的初始体温升高日期（6.29 天）比 SAT1 组（3.09 天）和 SAT2 组（3.95 天）延迟（p＜0.006）外，接触感染组之间在发热持续时间、峰值温度或峰值时间方面没有观察到统计学差异。

图1. 感染口蹄疫病毒的非洲水牛的体温。使用温度敏感数据记录仪测量的每只个体在针刺或接触感染口蹄疫病毒 SAT1（第 1 列）、SAT2（第 2 列）或 SAT3（最后一列）后的体温。由于读数反复偏高，一只 SAT1 接触感染的动物（动物 2）被排除在分析之外。图（A）表示随时间变化的原始体温。虚线表示通过计算参考范围确定的正常体温。图（B）表示拟合线的残差，如果残差值连续 6 小时（72 次读数）保持在虚线上方，则认为发热。体温在一天内波动，所有针刺感染和接触感染的水牛在病毒感染后 1-2 天（针刺感染）和约 5 天（接触感染）内出现高温，并持续升高约 3-4 天。SAT2 针刺感染组的初始体温升高较早，与 SAT1 针刺感染组和 SAT3 针刺感染组相比（p = 0.02），SAT3 接触感染组的发热出现延迟（p = 0.006），与 SAT2 和 SAT3 接触感染组相比。SAT1 针刺感染组的所有水牛以及 SAT2 和 SAT3 组的各一只动物在第 8 天出现了短暂的第二次高温峰值，仅持续约 1 天。

03. 血液、鼻腔拭子和口咽部的病毒动态

三个针刺感染组动物血清样本中的病毒基因组动态具有可比性（图 2A）。所有针刺感染的动物在感染后第 2 天检测到最高的口蹄疫病毒基因组拷贝数，这与首次在血液中检测到病毒的时间一致。血液中病毒基因组的检测在感染后第 4 至 6 天下降，到第 8 天检测不到。

图2. 非洲水牛中口蹄疫病毒基因组拷贝数动态。通过 RT-qPCR 检测针刺感染 SAT1、SAT2 和 SAT3 口蹄疫病毒血清型（蓝色线，圆形符号）与接触感染（粉色，方形符号）动物的血清（A）、扁桃体拭子（实线）和口咽刮取物（虚线）（B）以及鼻腔拭子（C）中的口蹄疫病毒基因组拷贝数（GCN）。针刺感染动物在研究的第 0 天进行针刺感染，接触感染动物在第 2 天与针刺感染组混群。图表表示每个时间点每个组的平均值和标准误差。

接触感染动物血清中的病毒基因组动态在组内差异更大，并且在血清型之间观察到一些差异。与 SAT2 和 SAT3 动物（分别在接触病毒后第 4 天和第 5 天）相比，SAT1 动物更早（接触病毒后第 2 天）检测到口蹄疫病毒基因组（p = 0.017），并且一般来说，与针刺感染动物相比，接触感染动物的口蹄疫病毒检测峰值出现得更晚，在接触病毒后第 4 天（p＜0.001）。无论感染途径如何，血清中可检测到的病毒基因组持续时间相似，并且发现接触感染组中 SAT1 组（6.5 天）的持续时间比 SAT2 组（4.5 天）和 SAT3 组（2.5 天）更长（p = 0.021）。相反，SAT2 水牛血清中的病毒基因组载量明显较低，中位数为 2.57 GCN/mL，而 SAT3 和 SAT1 分别为 3.24 GCN/mL 和 3.42 GCN/mL（p＜0.028）。

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在大多数动物中，无论感染途径如何，在接触病毒后第 2 天就可以在口咽部（OP）检测到口蹄疫病毒基因组（图 2B）。一般来说，基因组拷贝数（GCN）值在接触病毒后 3 至 6 天达到峰值，除了 SAT3 接触感染的动物，其峰值延迟到第 5 至 12 天（p＜0.045）。在实验的第 30 天之前，从所有水牛的扁桃体拭子中都能检测到口蹄疫病毒基因组。在实验的第 2 天至第 30 天，针刺感染动物口咽部的基因组拷贝数（GCN）高于接触感染的动物（p = 0.004），其中 SAT1 针刺感染组的值更高（5.43 GCN/mL），与 SAT2 和 SAT3 针刺感染组（分别为 5.39 GCN/mL 和 5.27 GCN/mL，p = 0.048）相比。在感染后第 30 天，使用 SAT 特异性引物对扁桃体拭子进行 RT-qPCR 分析，结果表明在实验期间单独饲养的任何组中都没有检测到交叉感染的证据（附加文件 6）。

血清中首次检测到口蹄疫病毒基因组与扁桃体拭子中首次检测到病毒相关（r² = 0.84），尽管在 12 只动物中有 3 只延迟了 2 天。同样，血液和扁桃体拭子中首次检测到病毒与体温的初始升高相关（分别为 r² = 0.96 和 0.84），不过发热可能在检测到病毒排出后 1.17（±1.3）天以及血液中出现病毒后 0.7（±0.7）天才能检测到（附加文件 7）。

针刺感染组和接触感染组分别在接触病毒后第 2 天和第 6.5 天（组平均值）首次在鼻腔拭子中检测到病毒基因组（图 2C）。大多数动物在感染后第 14 天检测结果为阴性。与血液和口咽部的高基因组拷贝数（GCN）相反，鼻腔拭子中的病毒基因组检测是间歇性的，针刺感染组和接触感染组的最高值分别达到 3.4 GCN/mL 和 3.34 GCN/mL。组间在鼻腔拭子中病毒排出的动态方面没有观察到统计学差异。

在研究的第 2 至 30 天，还通过病毒分离（VI）对血清、口咽刮取物、扁桃体和鼻腔拭子进行了分析。在接触病毒后的第 2 天和第 4 天，分别只有 66% 和 17% 的血清样本病毒分离呈阳性，这与这些天所有血清样本中较高的 RT-qPCR 值形成对比。在第 8 天、第 14 天和第 30 天，分别从 87% 和 71% 的扁桃体拭子和口咽刮取物的 RT-qPCR 阳性样本中分离出病毒。此外，所有病毒分离阳性样本中，扁桃体拭子的平均基因组拷贝数（GCN）更高（p＜0.001）（附加文件 8），这表明扁桃体拭子是检测非洲水牛中口蹄疫活病毒和基因组最可靠的样本。在实验的第 30 天，从 24 只（66.6%）感染动物中的 16 只（9 只针刺感染和 7 只接触感染）的扁桃体拭子和 / 或口咽刮取物中分离出有传染性的病毒（表 1），然而病毒接触途径与带毒状态之间没有关联（分别 p = 0.553）。从任何鼻腔分泌物中都无法分离出有传染性的病毒。

表1. 研究第 30 天时出现水疱的动物数量和带毒动物数量。

04. 对口蹄疫病毒的体液免疫反应

不同口蹄疫病毒南部非洲地区（SAT）血清型在针刺感染后诱导的特异性体液免疫反应没有显著差异，然而在接触感染组中观察到了差异（图 3A）。一般来说，感染口蹄疫病毒的水牛在感染后 2 至 6 天内产生病毒中和抗体滴度（VNTs）。首次检测到中和抗体滴度后迅速升高，并在研究结束的第 30 天一直保持在最高滴度。感染途径不影响中和抗体滴度的大小，但针刺感染的动物比接触感染的动物更快达到保护滴度（p＜0.002），并且在接触感染的动物中，SAT1 组的反应开始更快（p＜0.021），与针刺感染动物的水平相当。

图3. 口蹄疫病毒感染诱导的特异性体液免疫反应。由 SAT1、SAT2 和 SAT3 口蹄疫病毒感染的动物通过针刺感染（蓝色线，圆形符号）或接触攻毒（粉色，方形符号）诱导的中和抗体滴度（以 log10 表示）（A）以及抗口蹄疫病毒非结构蛋白（NSP）抗体水平的存在（B）。非结构蛋白（NSP）结果以抑制百分比（PI）表示，临界值确定为 50%（虚线）。图表表示每个时间点每个组的平均值和标准误差。

抗口蹄疫病毒非结构蛋白（NSP）的抗体在针刺感染组中于感染后第 8 天首次检测到，而在接触感染组中显著延迟（感染后第 12 天，p = 0.001）。非结构蛋白（NSP）抗体滴度在研究的第 30 天之前一直保持升高（图 3B）。

05. 感染口蹄疫病毒的水牛血清中结合珠蛋白和血清淀粉样蛋白 A 的水平

在水牛急性口蹄疫感染期间检测到了血清淀粉样蛋白 A（SAA）和结合珠蛋白。在病毒感染后，立即在所有水牛的血清中检测到高浓度的血清淀粉样蛋白 A（图 4A）。血清浓度迅速升高，并在感染后第 4 至 6 天达到峰值。峰值后浓度逐渐下降，到感染后第 14 天血清淀粉样蛋白 A 的水平检测不到。虽然不同血清型和感染途径之间的血清淀粉样蛋白 A 总反应没有差异，但接触感染动物中血清淀粉样蛋白 A 的诱导延迟（p＜0.004），不过与针刺感染动物相比，血液中血清淀粉样蛋白 A 的持续时间和峰值水平更高（p＜0.0007）。

图4. 口蹄疫病毒在非洲水牛中诱导的先天性免疫反应和急性期蛋白。感染 SAT1、SAT2 或 SAT3 口蹄疫病毒血清型的动物通过针刺感染（蓝色线，圆形符号）或接触攻毒（粉色线，方形符号）后血清中血清淀粉样蛋白 A（A）、结合珠蛋白（B）、I 型 / III 型干扰素（C）和 γ 干扰素（D）的浓度。图表表示每个时间点每个组的平均值和标准误差。血清淀粉样蛋白 A 和结合珠蛋白的临界值分别设定为 546 ng/µL 和 802 ng/µL，I 型干扰素和 γ 干扰素的临界值分别设定为 0.76 国际单位 /mL 和 1.04 ng/mL。

血清中结合珠蛋白的浓度也观察到了类似的动态（图 4B），尽管其水平维持的时间比血清淀粉样蛋白 A 更长；在研究的第 30 天，所有动物的结合珠蛋白水平恢复正常。不同感染途径之间血清中的结合珠蛋白没有观察到差异，但 SAT2 针刺感染组的反应幅度最高（p＜0.018）。

06. 感染口蹄疫病毒的水牛中诱导的先天性免疫反应

血清中 I 型 / III 型干扰素和 γ 干扰素的动态在对所有南部非洲地区（SAT）病毒感染的反应中非常相似（图 4C）。大多数动物在感染后（感染后第 2 天）很容易在血清中检测到 I 型 / III 型干扰素反应，持续约 6 天，但接触感染组中达到最高水平的时间更晚（感染后第 6 天对比感染后第 2 天）（p = 0.013）。同样，在感染后第 2 天检测到 γ 干扰素的诱导，并在感染后第 6 天达到峰值，接触感染动物的最高值高于针刺感染动物（p = 0.036）（图 4D）。不同血清型之间在 I 型 / III 型干扰素和 γ 干扰素抗病毒细胞因子的动态方面没有发现差异，然而一些接触感染组的动物甚至在检测到口蹄疫病毒之前就已经检测到这些细胞因子的水平（p = 0.031）。在感染口蹄疫病毒的水牛中不能始终检测到肿瘤坏死因子 -α（数据未显示）。

五、讨论

本研究对非洲水牛感染口蹄疫病毒后的病毒动态和免疫反应进行了最为全面的描述。非洲水牛的口蹄疫通常被认为症状轻微或无症状，因为即使在高剂量的口蹄疫病毒攻毒后，也几乎观察不到（或极少观察到）水疱。与之前的这些报道一致的是，仅在两只 SAT1 针刺感染的水牛和一只 SAT3 接触感染攻毒的水牛的齿垫上观察到了小水疱，这与牛在发热后通常会在多个部位（一般在蹄部和舌部）出现水疱的情况相反。然而，通过使用温度记录仪，我们首次证明了非洲水牛确实会受到口蹄疫病毒的全身性影响，并且在针刺感染后早期（平均 1.26 天）就会出现持续的发热反应，平均持续 3.34 天。一般来说，接触感染的动物在与针刺感染的水牛接触后的第一周内（平均 4.9 天）体温会升高。接触感染动物的体温初始升高与在血清和口咽部首次检测到口蹄疫病毒基因组的日期相关，尽管在口咽部和血清中检测到口蹄疫病毒基因组分别比检测到发热提前了 1.17（±1.3）天和 0.7（±0.7）天。这些结果表明，尽管接触感染组中发热的检测并不能更灵敏地确定病毒传播的时间，但它与水牛感染口蹄疫病毒期间的病毒传播密切相关，这与牛的情况类似。实际上，在没有口蹄疫病变的情况下，体温可能是非洲水牛病毒传播的最重要关联指标。有趣的是，与感染 SAT1 和 SAT3 的动物相比，SAT2 针刺感染的动物体温升高得更早，然而这种体温升高与血清中更高的病毒载量或口咽部的病毒复制并无关联。此外，在所有 SAT1 针刺感染以及一只 SAT2 针刺感染和 SAT3 针刺感染的动物中检测到的第二次发热峰值，与血液中检测到病毒也没有关联。在接触口蹄疫病毒的一周内，水牛血清中的血清淀粉样蛋白 A（SAA）水平也升高，这与在牛中检测到的情况类似。有趣的是，与感染 SAT1 和 SAT3 的动物相比，SAT2 针刺感染的动物血清中的结合珠蛋白水平更高（p＜0.018）。急性期蛋白是非特异性的炎症标志物，尽管大多数水牛没有表现出口蹄疫病变，但它们都受到了病毒感染的全身性影响。有研究表明，与处理和镇静相关的应激会导致血清中急性期蛋白（APPs）水平升高。然而，在我们的研究中这种情况被排除了，因为水牛在实验过程中的不同时间点进行了镇静处理，并且我们仅在血液和扁桃体拭子中检测到高病毒载量时，才观察到与急性期蛋白的正相关关系，这表明这些蛋白可以像之前所建议的那样，作为非洲水牛感染口蹄疫病毒的替代标志物。

据描述，牛的口蹄疫病毒具有高度传染性，其基本再生数（R0）估计在 21 到 88 之间，尽管传染期很短（1.7（0.3–4.8）天）。此外，在家牛中，病毒传播、空气中病毒的存在以及口蹄疫临床症状的出现之间存在正相关关系。在本研究中，尽管没有水疱，空气样本和鼻腔拭子中也没有检测到病毒，但所有接触感染的水牛在与针刺感染的动物接触后都很容易被感染。这些发现表明，在水牛之间，南部非洲地区（SAT）血清型病毒的密切接触传播可能比气溶胶传播更有效。需要进一步的研究来探究空气采样方案在测量急性感染水牛的病毒排放方面的检测限（例如，每天的变化和暴露时间），并研究在这种群居物种的个体之间最常见的传播形式是什么。

尽管在鼻腔拭子中对口蹄疫病毒的检测率较低，但在所有针刺感染动物感染后的前 4 至 6 天，在腭扁桃体拭子中检测到了高水平的病毒和病毒基因组。这些结果表明，扁桃体可能是水牛中传染性病毒的主要来源，而不像牛那样水疱病变是主要来源。当比较两种咽部样本时，通过逆转录定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测发现，扁桃体拭子中的病毒基因组拷贝数比口咽刮取物更高（p＜0.001）；这些结果证实了先前的发现，即扁桃体拭子在口蹄疫病毒诊断方面比口咽刮取物效果更好。扁桃体拭子中的病毒载量随时间下降；然而，在实验的第 30 天，仍有 66% 的水牛在排出病毒。

在大多数动物感染口蹄疫病毒后的第一周内，首次在扁桃体拭子和血液中同时检测到口蹄疫病毒，只有接触感染组的三只动物在扁桃体拭子中比在血液中更早检测到病毒。相反，针刺感染组的一只动物在血液中检测到口蹄疫病毒早于扁桃体拭子。有报道称，在牛中，口咽部检测到的病毒是最早的感染迹象；但当病毒水平超过一定阈值时，血液和鼻腔分泌物中的病毒也可能是感染前期传染性的良好指标。在本研究中，鼻腔拭子中病毒基因组的存在不容易检测到，并且在组内也不一致（24 只动物中有 5 只在所有时间点检测结果均为阴性）。

在感染的水牛血液中，大约在感染后 4 至 6 天可以检测到病毒基因组，这比在牛中检测到的持续时间更长（牛为感染后 2 至 4 天）。在中和抗体出现之前，血液中的病毒基因组与扁桃体拭子中病毒基因组的检测密切相关。在检测到中和抗体后不久，大约在感染后 6 天，病毒就从血液中完全清除。与牛类似，口咽部或扁桃体拭子中对口蹄疫病毒的检测不受中和抗体存在的影响。在中和抗体滴度达到最高值后的感染后期，腭扁桃体中仍维持着高口蹄疫病毒基因组拷贝数。实际上，在研究的第 30 天，从 24 只动物中的 16 只的扁桃体拭子和 / 或口咽刮取物中分离出了口蹄疫病毒，这些动物被确定为带毒者。正如在牛中所提出的那样，我们没有发现带毒状态与感染途径或宿主急性反应之间存在任何关联。我们和其他研究人员已经证明，水牛可以持续感染口蹄疫病毒数月甚至数年，尽管从带毒水牛向未感染水牛的传播很难重现，但最近的一项研究表明，正是偶尔从带毒者传播病毒，才使得口蹄疫病毒在孤立的非洲水牛种群中得以存续而不至于灭绝。

总之，这些结果表明，与牛相比，尽管临床结果存在明显差异，但非洲水牛在针刺感染或直接接触攻毒后，口蹄疫病毒感染和免疫反应的动态情况相似。此外，对于感染口蹄疫病毒的水牛（亚洲常见的家养水牛品种），也有类似的传播、病毒动态和中和抗体反应的描述；然而，水牛会像牛一样出现口蹄水疱。宿主物种之间临床结果不同的原因尚不清楚，此外，人们对导致牛口蹄水疱组织分布的机制也缺乏了解。我们首次证明，发热是非洲水牛口蹄疫的一个持续存在的临床症状。一般来说，针刺攻毒会导致血液和口咽部出现同步、更快且更高的病毒载量，以及特异性的体液免疫反应，而针刺感染和接触感染攻毒的水牛的先天性和急性免疫反应相似。这些差异可以解释为，与针刺感染组的高病毒剂量相比，接触感染组的感染时间不同且感染剂量较低。与 SAT2 和 SAT3 病毒相比，SAT1 病毒在攻毒后检测得更快，并且更容易传播给未感染的水牛。这些结果与我们之前的研究一致，在之前的研究中，我们对个体水牛进行混合感染实验，随着时间推移发现，与 SAT2 和 SAT3 病毒相比，SAT1 病毒持续的时间更长。这些结果也与我们在对一个孤立的水牛群进行的长期研究中所观察到的情况一致，该研究表明 SAT1 病毒在种群中更容易持续存在。

这些数据提供了重要信息，有助于理解牛和非洲水牛在对口蹄疫病毒感染的反应方面存在的明显临床差异。我们已经证明，非洲水牛典型的轻微临床症状并非是因为病毒复制或排出得到了控制，也与对口蹄疫病毒的免疫反应受到抑制无关。我们还证明，与急性感染的水牛接触的未感染水牛很容易被感染，尽管水疱液或病变中没有高滴度的病毒。需要进一步的研究来探究细胞介导的免疫反应，并确定这种免疫反应是否是导致非洲水牛与牛的临床结果明显不同的原因。这些数据为模拟非洲水牛宿主内病毒与免疫反应动态之间的相互作用，以及理解这些高传染性病毒在其自然宿主种群中的发病机制奠定了基础。

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